مقدمه:

شير هنگامي كه از غدد شیری دام سالم دوشيده شود، عاری از باکتری یا داراي تعداد بسيار كمي باكتري است. مقدار بار میکروبی کل یا شمارش کلی میکروبی در شیر ضمن اینکه به عنوان یک روش متداول و شاخص ترین معیار در روند ارزیابی کیفیت شیرخام است، به عنوان یکی از ملاکهای مهم پیش بینی سلامت گاو و بهداشت وضعیت شیردوشی و نشانگر چگونگی حمل و نقل و نگهداری شیرخام می باشد.
انتقال آلودگى باکتریایى از محیط شیردوشى و تجهیزات آن به شیر غیرقابل اجتناب است چرا که ههم فلور طبیعی سینه دام و هم فلور محیط خارج خیلی راحت به شیر انتقال پیدا می کنند، ولى با این حال شمارش کلى باکتریایى شیرى که تا حد مناسبى سرد شده و تحت شرایط مطلوبى تولید شده باشد، باید در حد کمتر از 10000 باکترى در هر میلى لیتر باقى بماند. اگر شمارش باکتریایى شیر به طور قابل ملاحظه اى افزایش یابد مثلاً به بیش از 3 میلیون در میلى لیتر برسد، چربى، پروتئین یا لاکتوز شیر تجزیه مى شود که این امر سبب به وجود آمدن بو و طعم نامطبوع در شیر شده و به طور چشمگیرى قابلیت نگهدارى و کاربرد شیر را کاهش مى دهد. تعداد کل باکتری های شیر در رابطه با ارزیابی مناسب آن برای مصرف انسان نه تنها مهم است، بلکه اهمیت بیشتر آن در امکان وجود باکتری هایی است که قادرند موجب ایجاد بیماری در مصرف کننده شوند. در این میان باکتری های بیماریزا چون بروسلا، استافیلوکوکوس ها، لیستریا، سل گاوی، کلی فرمها، سالمونلا و ..... که موجب بیماریهایی مثل تب مالت، سل، حصبه، لیستریوز، اسهال خونی و التهابات گوارشی می گردند، مهم هستند. كلي فرم ها، باسیل های گرم منفی، بدون اسپور، میله ای شکل، هوازی و یا بی هوازی اختیاری هستند كه می توانند در حرارت 30 الی 37 درجه سانتی گراد رشد كنند. اين موجودات بسادگي مي توانند باعث تخريب شير شده و در مدت 24 الی 48 ساعت لاكتوز را تخمیر کرده و به اسيد لاكتيك و گاز تبديل نمايند و پروتئين هاي موجود در شير را هم بشكنند. کلی فرم ها می توانند به عنوان درجه بندی میزان آلودگی فراورده های خام مورد بررسی قرار گیرند. منبع اصلی آنها روده حیوانات خون گرم است. نمونه بارز آن اشریشیا است، كه در اين دسته جاي مي گيرد. جنس اشریشیا شامل شش گونه است که گونه اشریشیاکلی گونه شاخص آن می باشد. اشریشیاکلی معمولترین میکروارگانیسم هوازی در دستگاه گوارش برخی حیوانات و انسان است و به عنوان معیار آلودگی آب و مواد غذایی به مدفوع مطرح می باشد.كلي فرم ها طي فرآيند پاستوريزاسيون و با حرارت سريع از بين مي روند و بعد از حرارت دادن، تكثير نمي يابند و حضورشان در شير بيانگر آلودگي ثانويه است. اشریشیاکلی از طریق آب، شیر و فراورده های آن و گوشت به انسان منتقل می شود. وجود کلی فرم های مدفوعی مانند اشریشیاکلی دلالت بر آلودگی شیرخام با مدفوع حیوانی و انسانی است. وجود آن در شیر پاستوریزه نشانه ناسالم بودن آن شیر برای مصرف انسانی است. بر اساس استاندارد های موجود لازم است تعداد کلی فرم در یک میلی لیتر شیرخام کمتر از 100 عدد باشد. هم چنین تعداد کلی فرم ها در یک میلی لیتر شیر پاستوریزه باید کمتر از 10 عدد و اشریشیا کلی در یک میلی لیتر شیر پاستوریزه نباید وجود داشته باشد.
از دیگر باکتری های موجود در شیر می توان استرپتوکوک ها، لاکتوباسیلوس ها، میکروکوکوس ها و ... را نام برد. تبQ ، عفونت های استرپتوکوکی، توبرکلوزیز، بروسلوزیز و ...نیز از مهمترین بیماری هایی هستند که توسط شیر ایجاد می شوند.
برای از بین بردن باکتری های شیر از پاستوریزه کردن استفاده می شود. پاستوريزه کردن را مى‌توان چنين تعريف کرد؛ گرم کردن شير به‌مدت و با درجه‌اى که براى نابود کردن هر گونه عامل بيمارى‌زائى احتمالى موجود در شير لازم است به‌شرط آنکه کمترين دگرگونى را در ترکيب شير به‌وجود آورد و طعم و ارزش غذائى آن را هم تغيير ندهد.

با پاستوريزه کردن، نزديک به نود درصد ميکروب‌هاى شير از بين مى‌روند؛ از جمله ميکرو‌ب‌هاى سل که بيشتر در گرما پايدار هستند و عامل تب Q ولى با پاستوريزه کردن نه هاگ ميکروب‌ها و نه ميکروب‌هاى گرما پايدار از بين نمى‌روند و از اين‌رو با وجود پاستوريزه کردن شير، چون گرماى محيط بعداً بالا مى‌رود ميکروب‌ها به فراوانى تکثير مى‌يابند و براى کنترل رشد خون زيست‌مندان شير پاستوريزه به‌سرعت تا چهار درجه صد قسمتى خنک مى‌شود و بايد تا زمان مصرف خنک بماند. فرآورده‌هاى شير پاستوريزه در جاهاى گرمسير در گرماى هجده درجه صد قسمتى بيش از هشت تا دوازده ساعت بهداشتى و سالم نمى‌مانند.
یکی از آزمایش هایی که به منظور ارزیابی کیفیت باکتریایی شیر خام صورت می گیرد، آزمایش احیای متیلن بلو است. اساس این آزمایش احیای متیلن بلوی افزوده شده به شیر، در اثر فعالیت متابولیکی باکتری های آن و بی رنگ شدن متیلن بلو می باشد. این آزمایش مبتنی بر این است كه باكتری های موجود در شیر در دمای مناسب به سرعت رشد كرده و اكسیژن محیط را مصرف كنند در اثر مصرف اكسیژن ، حالت شیمیایی محیط تغییر كرده و پتانسیل اكسیداسیون و احیاء پایین می آید . برای تخمین زدن میزان فعالیت باكتری ها ، متیلن بلو ( شناساگر حالت اكسیداسیون و احیاء ) به شیر افزوده می شود . این شناساگر در ابتدا رنگ آبی دارد . اما پس از مصرف شدن اكسیژن محیط توسط باكتری های موجود در شیر رنگ خود را از دست داده و بی رنگ می شود .به طور كلی ، طول مدت احیاء با تعداد باكتری های موجود در شیر نسبت عكس دارد . یعنی هر چه تعداد باكتری ها زیاد تر باشد زمان كمتری برای تغییر رنگ متیلن بلو لازم است . برای تسریع رشد باكتری های موجود در شیر و كاهش طول مدت آزمایش ، پس از افزودن شناساگر ، باید نمونه شیر را در دمای كنترل شده قرار داد . اگر متیلن بلو در کمتر از 30 دقیقه بی رنگ شود، کیفیت شیر بسیار پایین بوده و در کلاس 4 قرار می گیرد. کلاس 3 شیرهایی هستند که کیفیت پایینی دارند و متیلن بلو در آنها پس از 30 دقیقه تا 2 ساعت بی نگ می شود.کلاس 2 کیفیت بهتری داشته و در مورد شیرهایی تعریف می شود که عمل احیای متیلن بلو در آنها بین 2 تا 6 ساعت انجام می شود.بهترین کیفیت شیر نیز زمانی است که متیلن بلو بتواند در آن تا 8 ساعت احیا نشده بماند. متیلن بلو دارای فرمول بسته C₁₆H₁₈N₃SCl و فرمول ساختاری به شکل زیر است:


شرح آزمایش:

مواد و لوازم مورد نیاز: نمونه شیر ( در اینجا شیرهای استریل فروشی در سوپرمارکت ها) ، متیلن بلو ، محیط کشتNA ، پلیت، لوله آزمایش، آب مقطر استریل، بن ماری، انکوباتور، ورتکس و ...

روش کار:

الف) Reduction test : میز کار را کاملا استریل کرده و در کنار شعله روشن با استفاده از چاقوی استریل شده روی شعله در پاکت شیر را باز کرده و با استفاده از پیپت استریل، 10 میلی لیتر شیر را برداشته و به لوله آزمایش در دار استریل انتقال می دهیم. سر لوله آزمایش را با درپوش بسته و شیر را روی ورتکس 25 بار تکان می دهیم.سپس در کنار شعله یک میلی لیتر متیلن بلو به آن می افزایم ، در لوله را بسته و لوله را چند بار اینورت می کنیم تا رنگ کاملا با شیر مخلوط شود.سپس لوله را در بن ماری گذاشته و برای بار اول پس از 5 دقیقه بیرون آورده و 3 بار اینورت کرده و مجددا در بن ماری می گزاریم.برای دفعات بعد این کار را با فاصله های زمانی 30 دقیقه انجام می دهیم و هر بار تغییر رنگ را بررسی می کنیم تا ببینم متیلن بلو پس از چه زمانی بی رنگ می شود.


ب) تست Colony count : این تست برای شمارش میکرو ارگانیسم های موجود در شیر انجام می شود. از شیر سریال دایلوشن تهیه می کنیم.بدین طریق که یک سی سی از شیر را در کنار شعله به یک لوله آزمایش حاوی 9 میلی لیتر آب استریل در افزوده و پس از پنبه گذاری چند بار تکان داده و بعد با چند بار پیپتینگ محلول را یکنواخت کرده و یک سی سی از آن را برداشته و به لوله آزمایش دیگری که آن نیز حاوی 9 سی سی آب مقطر استریل است انتقال می دهیم. این کارها را تا جایی تکرار می کنیم که تمامی رقت های مورد آزمایش را داشته باشیم( رقت های 0.1، 0.01، 0.001 و ...). سپس از هر رقت یک سی سی برداشته و در کنار شعله درون پلیت استریل ریخته و کشت پور پلیت را برای آن انجام می دهیم.
پس از انکوباسیون گذاری و گذشت زمان، رشد کلنی های باکتریایی را در پلیت ها بررسی می کنیم. با شمارش کلنی ها و ضرب تعداد کلنی در عکس رقت میزان باکتری در یک سی سی از شیر مورد آزمایش به دست می آید

منبع:www.iran-stu.com/.